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視網(wǎng)膜是人類認識世界的重要窗口，其中，視網(wǎng)膜色素上皮細胞（RPE）是其重要 “守護者”。RPE細胞功能異常可引發(fā)視網(wǎng)膜變性，進而導(dǎo)致不可逆的視力損傷乃至失明。近日，溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院眼發(fā)育細胞生物學(xué)與疾病研究組（麻曉銀/侯陵）團隊在Free Radical Biology and Medicine （Top期刊、IF: 8.2）雜志發(fā)表題為“MITF promotes MFN2-dependent mitochondrial fusion to protect retinal pigment epithelial cells from mitochondrial damage”的研究論文，該研究聚焦視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細胞的線粒體穩(wěn)態(tài)，證明了小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子（MITF）通過促進 MFN2 依賴的線粒體融合，加深了對線粒體融合-分裂調(diào)控機制的認識， 為 RPE 細胞“護航”抵御線粒體損傷和視網(wǎng)膜退行性疾病的防治提供了新的思考和實驗數(shù)據(jù)支持。

為了研究MITF在視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細胞線粒體調(diào)節(jié)中的功能作用，團隊通過體內(nèi)體外實驗進行多層級驗證。在動物實驗中，透射電鏡顯示 MITF 過表達轉(zhuǎn)基因小鼠（Dct-Mitf）的 RPE 細胞線粒體長寬比顯著高于野生型，而 MITF 雜合子小鼠（Mitf-/+）線粒體長寬比和平均線粒體網(wǎng)絡(luò)均低于野生型，呈碎片化狀態(tài)（圖1A-C）；在小鼠原代 RPE 細胞中，經(jīng) MitoTracker 染色后共聚焦成像進一步證實，Dct-Mitf小鼠線粒體長度、網(wǎng)絡(luò)規(guī)模和長寬比更大，Mitf-/+小鼠則相反（圖1D-G）；在人源ARPE-19細胞通過pDsRed2-Mito標示線粒體病證實高表達MITF細胞中線粒體多為融合和伸長的形態(tài)，平均長度更長，平均線粒體網(wǎng)絡(luò)更多，長寬比更大（圖1H-N）。以上結(jié)果表明MITF 參與 RPE 細胞線粒體形態(tài)調(diào)節(jié)，并促進RPE細胞的線粒體融合。

圖1 MITF 促進 RPE 細胞線粒體融合

之后，研究者通過敲低實驗反向驗證 MITF對線粒體形態(tài)的必要性。使用Mito-COX8-GFP標記線粒體使其自帶綠色熒光。在小鼠原代RPE細胞和ARPE-19細胞中研究證實干擾MITF表達可促進線粒體碎片化（圖2），提示MITF在線粒體形態(tài)和線粒體融合的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。

圖2 干擾 MITF后RPE細胞線粒體碎片化增加

為了進一步研究MITF對于線粒體功能的影響，研究者使用線粒體電子傳遞鏈解偶聯(lián)劑CCCP誘導(dǎo)RPE細胞線粒體損傷。結(jié)果表明RPE細胞中高表達MITF能夠保護RPE細胞抵御CCCP誘導(dǎo)引起的線粒體損傷（圖3）和細胞死亡（圖4）。

圖3 過表達 MITF 抵御 CCCP 誘導(dǎo)的線粒體損傷。

圖4 過表達MITF保護CCCP誘導(dǎo)線粒體損傷后的RPE細胞

在機制研究中，研究者通過染色體免疫共沉淀（ChIP）、雙熒光素酶報告實驗等研究手段，揭示了MITF通過直接結(jié)合到MFN2基因啟動子區(qū)域、轉(zhuǎn)錄起始位點上游671位的E-box結(jié)合位點（CATGTG）并激活MFN2的表達，對該結(jié)合位點進行突變之后（TGCACA）則失去對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力（圖5）。

圖5 MITF通過與MFN2的啟動子區(qū)域結(jié)合，直接調(diào)控MFN2的表達

為了進一步在體研究MITF保護RPE/視網(wǎng)膜抵御線粒體損傷的作用，研究人員對小鼠玻璃體腔進行注射 CCCP 72 小時后，通過眼底彩照、視網(wǎng)膜切片HE染色、RPE細胞鋪片染色等研究手段證實在相同CCCP處理情況下，MITF低表達小鼠RPE/視網(wǎng)膜損傷加重，而高表達MITF則能保護RPE/視網(wǎng)膜損傷抵御CCCP誘導(dǎo)的線粒體損傷，提示在體 MITF 表達增加對 RPE 存在保護作用，有助于抵御線粒體損傷引起的視網(wǎng)膜受損。

圖6 過表達 MITF在體保護CCCP誘導(dǎo)損傷后視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)

由于MITF在視網(wǎng)膜的RPE細胞中特異性表達，研究人員進一步利用RPE特異性 RPE65 啟動子構(gòu)建AAV9-MITF表達載體，在小鼠中進行視網(wǎng)膜下注射AAV9病毒，免疫熒光證實 MITF 上調(diào)（圖7A）；CCCP 誘導(dǎo)損傷后，AAV9-MITF 組眼底損傷面積顯著小于對照（圖7C-D），H&E 染色和 RPE 鋪片顯示其 RPE 細胞結(jié)構(gòu)和連接更完整（圖 7B-E），證明RPE細胞特異性高表達MITF能夠有效保護視網(wǎng)膜抵御CCCP誘導(dǎo)的損傷。

圖7 AAV介導(dǎo)的RPE特異性MITF過表達可保護RPE免受CCCP誘導(dǎo)的線粒體損傷

最后，研究者又采用線粒體靶向抗氧化劑SkQ-1 納米顆粒（SkQ-1 NP）并將其應(yīng)用于Mitf-/+小鼠在CCCP誘導(dǎo)引起的視網(wǎng)膜損傷的干預(yù)研究。結(jié)果證實治療組視網(wǎng)膜損傷面積僅為對照組的 1/3，并且其RPE細胞連接更完整，結(jié)構(gòu)損傷更輕（圖8），表明線粒體靶向抗氧化劑可作為 MITF 功能缺陷的替代治療方案。

圖8線粒體靶向的SKQ-1納米顆粒治療CCCP誘導(dǎo)的Mitf? /+小鼠RPE損傷。

總結(jié)與展望

本研究闡明MITF 通過直接結(jié)合 MFN2 啟動子并激活其轉(zhuǎn)錄，促進 RPE 細胞的線粒體融合，從而增強 RPE /視網(wǎng)膜抵御線粒體損傷的能力；SkQ-1 NP可在Mitf 單倍劑量不足小鼠上緩解CCCP誘導(dǎo)的 RPE /視網(wǎng)膜損傷。后續(xù)研究可進一步探索MITF調(diào)控其他影響線粒體動態(tài)平衡（如線粒體自噬、分裂等）或其他細胞過程的機制；此外，在臨床轉(zhuǎn)化層面，可通過優(yōu)化線粒體靶向藥物 SkQ-1 納米顆粒的遞送方式，并開發(fā)針對 MITF-MFN2 通路的藥物，進一步挖掘其治療相關(guān)疾病的潛力，推動研究成果向臨床轉(zhuǎn)化。

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院眼發(fā)育細胞生物學(xué)與疾病研究組研究生陳迎澳、盧婉妮、李平平是論文的共同第一作者。麻曉銀研究員、侯陵研究員是該論文的共同通訊作者。該工作得到了溫州醫(yī)科大學(xué)眼視光醫(yī)院國家工程中心林森副研究員、視覺健康全國重點實驗室高美玲副研究員的大力支持；得到了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金的經(jīng)費資助。